Magnus Ehingers under­visning

— Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Inledning

Du ska studera ett enzyms tredimensionella struktur, och därigenom få förståelse för hur proteinets struktur hänger samman med dess funktion. Den här övningen ger dig tillfälle att använda strukturinformation från en internationell databas, och att få uppleva hur denna nya information kan öka vår kunskap om enzymer och deras verkningssätt. Du kommer att arbeta med en liten del av den otroliga mängd information som nu finns lagrad i olika databaser över hela världen. Sedan några år har denna information gjorts tillgänglig för dagens gymnasieelever och morgonda­gens biotekniker via internet på vanliga nätverksanslutna persondatorer, genom vanliga webbläsare. Du får också lära dig mer om hur man använ­der Jmol, ett interaktivt grafikprogram för att studera makromolekylers tredimensionella struktur.

Ett enzym liknar på många sätt en industriell robot, där olika delar rör sig för att kunna utföra en viss uppgift, t.ex. skruva i en speciell skruv eller klippa upp en speciell bit plåt. För att förstå robotens funktion, är det nödvändigt att man studerar robotens olika delar och ser hur de rör sig tillsammans för att gripa, snurra, klippa osv. På samma sätt måste man, för att förstå ett proteins funktion, veta precis hur det ser ut.

Ett protein är som bekant betydligt mindre än en industriell robot, vilket gör det lite knepigt att studera. Inte ens med de starkaste mikroskopen går det att studera ett protein så att man kan bilda sig en vettig uppfattning om dess struktur. Istället kan man använda sig av en metod som kallas för rönt­genkristallografi. Den går ut på att man skapar kristaller av sitt protein (på liknande sätt som kristaller av salt), som man sedan belyser ur olika vinklar med röntgenstrålning. Röntgenstrålar har kortare våglängd än synligt ljus, och ju kortare våglängd, desto finare detaljer kan man urskilja.

När röntgenstrålarna träffar det kristalliserade proteinet, sprids de på ett särskilt sätt, som kan fångas upp på fotografisk film eller, modernare, på en fluorescerande skärm som sedan skannas av och läses in direkt i en dator. Med hjälp av kraftfulla datorer och många och långa beräkningar får man till slut en karta med X, Y, Z-koordinaterna för alla atomerna i proteinet. Det är denna karta för proteinet alkoholdehydrogenas vi ska studera i denna övning.

Etanol kan i levern oxideras till acetaldehyd (etanal) enligt reaktionen

CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+

genom att en hydridjon (två elektroner och en proton) överförs till NAD+ (nikotinamidadenindinukleotid) Denna reaktion, oxidation av etanol och reduktion av NAD+, katalyseras av enzymet alkoholdehydrogenas. Kataly­sen sker i en särskild del av det stora enzymet, i enzymets aktiva centrum, där en etanol-molekyl och en NAD-molekyl kommer i nära kontakt med varandra och aktiveringsenergin sänks genom interaktion mellan reaktan­terna och specifika aminosyragrupper. Du ska i denna övning konstatera var på denna stora enzymmolekyl som katalysen sker.

Tidsåtgång

Laborationen tar ett labbtillfälle à c:a 80 minuter

Materiel

Du behöver en dator med programmet Jmol och datafilen 1adc.pdb instal­lerade (enligt instruktioner på den här sidan). Jmol är skrivet helt i Java, och går att köra på vilket system som helst som har Java L4 eller senare installerat.

Övningen är för närvarande anpassad till Jmol v13.2. Senare versioner av Jmol gör att andra färger kommer att framträda i strukturen.

Säkerhet

Denna laboration är helt riskfri.

Gör såhär

 

Övningen är gjord på så vis, att du själv kan gå igenom alla delar. Det kan dock vara lämpligt att läraren visar hur man gör fram till och med punkt 4b.

Senaste versionen av Jmol är i skrivande stund 13.0.14, och den här övningen har utformats för att fungera optimalt med just den versionen. Med största sannolikhet går det att köra även med andra versioner av programmet, men vissa funktioner kan då vara knepiga att utföra.

OBS! När du utför övningarna bör du ha tillgång till en förteckning över struktur­formlerna för de olika aminosyrorna.

  1. Om du inte redan har gjort det: Ladda ner och installera programmet Jmol enligt instruktioner på den här sidan.
  2. Om du inte redan har gjort det: Ladda ner och spara filen 1adc.pdb enligt instruktioner på den här sidan.
  3. Om du inte redan har gjort det: Starta programmet Jmol och öppna filen 1adc.pdb enligt instruktioner på den här sidan.
  4. När du öppnat filen 1adc.pdb visas den först i s.k. ”Bandutförande”, där man ser β-strukturer som gula band, α-helixar som röda band, svängar som blå ”snören” och övrigt som vita ”snören”. Pröva att vrida runt enzymet på skärmen genom att klicka och dra någonstans i bilden.
    1. Högerklicka någonstans i bilden och välj ”Visa > Schema > Kula och pinne”. Då visas alla atomer som kulor och kovalenta bindningar som pinnar. De flesta väteatomer finns inte med i den här strukturen.
    2. Högerklicka någonstans i bilden och välj ”Visa > Schema > CPK Spacefill”. När du gör detta visas atomerna som sfärer med en atomradie (van der Waals-radie. Du kan nu identifiera kolatomer (gråa), syreatomer (röda), kvä­veatomer (blåa) och svavelatomer (gula).
  5. Högerklicka i bilden och välj ”Färg > Atomer > Efter schema > Aminosyra”. Då kommer varje slag av aminosyra att få sin egen färg.
    1. Placera muspekaren över en aminosyra, vilken som helst, t.ex. en blå. Klicka inte. Efter en kort stund dyker det upp en ljusgul ruta där det står något i stil med "[LYS]247:B.CA#5659". Det betyder att muspekaren just nu pekar på atom nummer 5659, som råkar vara kolatom A (CA) i aminosyran lysin (LYS) i kedja B.
    2. Placera muspekaren över olika aminosyror i proteinet. Besvara följande fråga: Vilken typ av aminosyra bör det finnas flest av på proteinets yta? Hydrofoba eller hydrofila? Motivera ditt svar!
  6. Högerklicka i bilden och välj ”Färg > Atomer > Efter schema > Kedja. Varje polypeptidkedja (subenhet) i proteinet får nu en egen färg. Även de ingående prostetiska grupperna och reaktanterna, dvs. NAD (PAD) och etanol får egna färger.

    Besvara följande frågor:
    1. Vad är det som visas med vit färg, något mörkare grön och något mörkare blå färg i bilden? Peka med muspekaren och identifiera grupperna!
    2. Hur många subenheter (polypeptidkedjor) består enzymet alko­holdehydrogenasav? Vrid och vänd på proteinet för att identifiera dem!
    3. Hur skulle du själv vilja beskriva alkoholdehydrogenasetsgeo­metriska form? Som en boll? Eller kanske enlåda?
  7. Genom att klicka och dra med musen i bilden kan du vrida och vända på proteinet på olika sätt. Lägg märke till vad som händer om du
    1. håller Shift-tangenten nere samtidigt som du håller musknappen intryckt och rör musen upp eller ner;
    2. håller Shift-tangenten nere samtidigt som du håller musknappen intryckt och rör musen åt höger eller åt vänster; och
    3. håller Ctrl-tangenten nere, samtidigt som du klickar med höger musknapp och rör musen åt något håll.
  8. Högerklicka i bilden och välj ”Färg > Atomer > Efter Schema > Sekundär struktur. Då kommer olika typer av sekundärstruk­turer att få olika färg: α-helixar blir röda, β-plattor blir gula, s.k. svängar, där peptidkedjan ändrar riktning med omkring 180 grader blir blå och resten av kedjan blir gråvit. Du ser de här strukturerna tydligare om du högerklickar i bilden, och väljer ”Visa > Schema > Avbild”.

    Besvara följande fråga:
    1. β-plattor är ofta solfjäderformade. Vad menas med detta? Vrid och vänd på molekylen så att du tittar längs en β-platta från sidan, och förklara! Gå in i menyn ”Exportera > Exportera bild” och spara en bild där ”solfjäderstrukturen” är tydligt synlig.
  9. För att studera enzymets aktiva yta ska du nu behandla bilden ytterligare.
    1. Först ska du göra koenzymet PAD alldeles rött i pinn-modell. Detta för att kunna se bättre var det sitter någonstans.
      1. Högerklicka i bilden och välj ”Välj > Hetero > Efter HETATM > PAD – SEE REMARK 5”.
      2. Högerklicka i bilden och välj ”Visa > Schema > Pinnar
      3. Högerklicka i bilden och välj ”Färg > Bindningar > Röd”.
    2. Nu ska du också se efter var etanolmolekylen finns
      1. Högerklicka i bilden och välj ”Välj > Hetero > Efter HETATM > EOH – ETHANOL”.
      2. Högerklicka i bilden och välj ”Visa > Schema > Pinnar”.
      3. Högerklicka i bilden och välj ”Färg > Bindningar > Cyanblå
    3. En zinkjon ingår också i strukturen, och är viktig för reaktionen. Den ska vi visa och färga gul.
      1. Högerklicka i bilden och välj ”Välj > Hetero > Efter HETATM > ZN – ZINC ION”.
      2. Högerklicka i bilden och välj ”Visa > Schema > CPK Spacefill”.
      3. Högerklicka i bilden och välj ”Färg > Atomer > Gul”.
  10. I den alkoholdehydrogenas-struktur som du nu studerar har NAD+ ersatts med ett annat ämne, PAD (pikolinamidadenindinukleotid). PAD är en analog till NAD+, vilket innebär att strukturen för PAD och NAD+ är nästan densamma. PAD skiljer sig från NAD+ endast på kväveatomens pla­cering i nikotinamid-ringen. Strukturen för NAD+, NADH respektive PAD framgår av figuren nedan.

    Strukturerna för NADH, NAD+ och PAD.

    Titta på bilden på datorskärmen. Enzymet består av två subenheter (polypeptidkedjor). De två subenheterna är identiska, vilket gör alkoholdehydrogenas till en s.k. homodimer, och därför framträder nu två identiska aktiva centra. Vrid och vänd på hela härligheten, zooma in på någon av etanolmolekylerna, och se hur den sitter intill NAD-analogen PAD (rödfärgad).

    Besvara följande frågor:
    1. Vilken del av PAD ligger närmast etanolmolekylen?
    2. Vilken del av NAD+ motsvarar det?
    3. Hur stämmer det överens med vad som händer med NAD när den reduceras (och alkoholen oxideras)?
  11. Vrid, vänd och zooma på molekylen, så att du får en snygg bild av etanolen tillsammans med PAD, inbäddat i molekylen. Försök att utifrån din bild föreställa dig hur etanolen tar sig in till det aktiva centrumet, oxideras, och hur sedan acetaldehyd lämnar proteinet! Gå in i menyn ”Exportera > Exportera bild” och spara bilden på din dator.
  12. För att du ska få en uppfattning om hur viktig ett proteins struktur är för dess funktion, ska vi nu titta på hur väl PAD (och NAD+) passar in i enzymet. Först ska du göra hela proteinet till stor vit massa.
    1. Välj alla atomer i strukturen genom att högerklicka i bilden och välja ”Välj > Alla”.
    2. Högerklicka i bilden och välj ”Visa > Schema > CPK Spacefill”.
    3. Högerklicka i bilden och välj ”Färg > Atomer > Vit”.
    Nu ska du belysa PAD-strukturen, och titta på hur väl just den passar i enzymet.
    1. Högerklicka i bilden och välj ”Välj > Hetero > Efter HETATM > PAD – SEE REMARK 5”.
    2. Högerklicka i bilden och välj ”Visa > Schema > CPK Spacefill”.
    3. Zooma in på en av PAD-molekylerna, och se hur den praktiskt taget sitter ”inklämd” mellan de andra atomerna i enzymet.
    4. Försök titta på adeninresten i PAD från sidan. Lägg särskilt märke till hur den platt den är, och hur tajt den sitter i sin lilla ”ficka”!
    5. Välj ”Visa > Schema > Kula och pinne”. Nu blir det ännu tydligare hur strukturen i alkoholdehydrogenaset bildar en ”ficka” som PAD (NAD+) passar precis i.
    6. Gå in i menyn ”Exportera > Exportera bild” och spara en snygg bild som visar hur PAD sitter i enzymets ficka.
  13. Pröva gärna lite andra vyer för att utforska molekylen.
    1. Välj först vilka atomer du vill ändra utseendet på genom att gå in i menyn "Välj >" och sedan välja exempelvis ”Alla”, ”Protein > Alla” (endast atomerna som ingår i själva proteinet) eller ”Hetero > …” (atomer som inte ingår i själva proteinet).
    2. Pröva någon annan vy genom att gå in i menyn ”Visa >” och välja t.ex. någon 3D-vy eller Schema.
  14. När du har fått fram en snygg bild, så går du in menyn ”Exportera > Exportera bild”. Spara bilden och lämna in den tillsammans med svar på frågorna.

Tillkännagivande

Ursprunget till den här övningen kommer från en datorövning jag själv var med om att att arbeta om på Lunds Universitet i slutet av 1990-talet. Här har jag dock skrivit om den rejält, uppdaterat den och anpassat till mina egna behov.