Kloningsvektorer kommer i minst fem olika smaker: Plasmider, bakteriofager, cosmider BAC:s (Bacterial Artifical Chromosomes) och YAC:s (Yeast Artificial Chromosomes)
Plasmider
Består av cirkulärt (ringslutet) DNA
Mellan 5 000 - 400 000 baspar
Lever ett "eget" liv inne i bakterien
Bakterier kan ta upp DNA genom en process som kallas transformation.
Man kyler bakterierna i nollgradig CaCl2 -lösning.
Sedan värmechockar man dem i temperaturer uppemot 37-43°C.
Nu blir bakterierna kompetenta: De kan ta upp extracellulärt DNA (DNA utanför cellen)
Endast ett fåtal bakterier (i storleksordningen en på tiotusen - eller ännu färre!) tar upp plasmiden i fråga
Man behöver en metod för att skilja ut (selektera) den eller de celler som tagit upp plasmiden!
Vanligen konstruerar man sin plasmid så, att den innehåller ett antal antibiotikaresistens-gener.
- Antibiotikaresistens-generna fungerar som selektionsmarkörer .
Genom att platta ut sina bakterier på en agarplatta som innehåller antibiotika, kan man se vilka bakterier som tagit upp plasmiden: Endast de som tagit upp plasmiden är ju antibiotikaresistenta!
En plasmid-vektor.
Detta visar bara att plasmiden tagits upp. Hur skall vi veta att även "vårt" DNA ligerats i plasmiden?
T.ex. genom att ha en restriktionsplats mitt i en annan resistensgen.
- Om plasmiden innehåller "vårt" DNA, har den förlorat resistens för ett visst antibiotikum
- Man tar några bakterier från en koloni som har överlevt den första antibiotikan, och testar om de överlever på det andra antibiotikumet.
- Överlever inte? Kolonin innehåller "vårt" DNA!
Man kan också länka "sitt" DNA med en annan resistensgen.
- Om bakterierna växer på medium med både det första och det andra antibiotikumet, har det tagit upp "vårt" DNA.
Bakteriofager
Med plasmider kan föra in vanligtvis upp till 1 000–10 000 baspar i en värdcell, men upp till 15 000 baspar har rapporterats. För större DNA-segment kan bakteriofager vara lämpliga.
Bakteriofag λ kan utan vidare leverera hela sitt genom på 48 502 baspar in i en E. coli -cell.
Ungefär 1/3 av bakteriofag λ:s genom behövs inte för överföringen.
- Detta "onödiga" DNA kan klippas bort med restriktionsenzymer
- I stället kan man med hjälp av DNA-ligas klistra in upp till 23 000 baspar, innehållande den gen man själv är intresserad av.
Det rekombinanta λ-DNA:t kan föras in i viruspartiklar genom att man blandar dem med extrakt från infekterade celler, vilka innehåller alla proteiner som behövs för att sätta ihop kompletta viruspartiklar.
- Detta kallas för in vitro-paketering.
Cosmider
Cosmider kan sägas vara rekombinanta plasmider, som kombinerar egenskaper från bakteriofag λ och plasmider
Cosmider är utformade för att klona upp till 45 000 baspar.
En bra (användbar) cosmid är utformad på följande sätt:
- Litet, ringformat DNA, typiskt 5 000 till 7 000 baspar
- ORI (origin of replication, replikationsursprung)
- En eller fler selektionsmarkörer
- Ett antal unika restriktionsställen
- Ett s.k. cos-ställe (en DNA-sekvens från bakteriofag λ, som krävs för paketering)
Cosmiderna packas in vitro i fagpartiklar.
När cosmiden kommit in i bakteriecellen, sprids den som en plasmid.
Bacterial och Yeast Artificial Chromosomes (BAC:s och YAC:s)
Mycket stora DNA-fragment (50 000 - 100 000 baspar och över) kan klonas.
Jäst (eng. yeast ) är en viktig värd för eukaryot rekombinant DNA.
