Klonade gener kan uttryckas i en värdcell

1. Producera protein eller studera genproduktens funktion
2. Studera just den här genens funktion

1. Eukaryot – människa eller mus – gen
2. Om vi vill ha stora mängder protein, hur gör vi då?
3. Få E. coli att göra det åt oss!
4. Hur...?

   Man måste ha ett sätt att...

   1. föra in genen i E. coli.
      1. En vektor
   2. särskilja de E. coli som tagit upp genen, från de som inte gjort det
      1. En selektionsmarkör
   3. få E. coli att börja uttrycka proteinet
      1. En induktionsmekanism

Vektorn skall ge oss allt det ovanstående (se nedan)!

Typiskt: En plasmid (men kan vara annat också, som vi skall få se).

1. Promotor
2. Operator
3. Bindningsställe för ribosom
4. Polylinker (kloningskassett)
   1. Innehåller en räcka unika igenkänningssekvenser (d.v.s. de finns ingen annanstans i vektorn) för olika restriktionsenzymer
5. Termineringssekvens för transkription
6. Selektionsmarkör (vanligen antibiotikaresistens)
7. ori
8. Repressor som binder operatorn och reglerar promotorn

1. Vi har klippt ut, och renat upp vårt DNA från eukaryota celler. Vad gör vi nu?
2. Det restriktionsenzym vi använde, har ju en viss igenkänningssekvens
3. Nu väljer vi att klippa upp vår vektor med samma enzym, med igenkänningssekvens i polylinkern, så att vi lätt kan klistra in vår gen där.
4. Rita upp detta!

1. Finns där, därför att de promotorer och som finns i den eukaryota cellen inte fungerar i E. coli. Den eukaryota promotorn och operatorn har man inte med, när man bara är intresserad av genprodukten.

1. OBS: Ribosomen binder inte till DNA!
2. När DNA:t transkriberas till mRNA, bildas ett bindningsställe för ribosomen.
3. Behövs för att translationen skall vara så effektiv som möjligt

1. Tja, vi behöver ju inte transkribera hela plasmiden, om och om igen...

1. När man för över vektorn till E. coli, tas den upp av kanske en cell av tio- eller hundratusen.
2. Hur veta vem som gjort det?
3. Genom att odla cellerna på antibiotikainnehållande medium!
4. Endast de celler, som tagit upp plasmiden överlever! :-)

1. Plasmiden (vektorn) vill man gärna skall finnas i så stort antal som möjligt i cellen.
2. Endast möjligt om den kan replikeras av cellen
3. För replikation är ett ori nödvändigt

1. Denna vill man skall vara inducerbar
2. Proteinet man vill undersöka, kanske är skadligt för bakterien.
   1. Därför vill man kontrollera när och hur det uttrycks!
3. Exempelvis en lac-repressor, som aktiveras när cellerna odlas på laktosinnehållande medium.
4. Då produceras också det önskade proteinet i stor mängd.